Blog

Các hạt nano (NP) hiện đang được phát triển để vận chuyển thuốc và chụp ảnh phân tử. Tuy nhiên, chúng thường bị chặn lại trước khi đến được mục tiêu, dẫn đến hiệu quả nhắm mục tiêu thấp và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu kém. Các hạt nano này có xu hướng tích tụ tại các cơ quan như phổi, gan, thận và lách.

Giải pháp khắc phục là thiết kế lặp lại các đặc tính bề mặt của NP và các chiến lược đưa thuốc, nhưng đây là một quy trình tốn thời gian, bao gồm cả việc mổ xẻ cơ quan tại các thời điểm khác nhau.

Để cải thiện điều này, chúng tôi đề xuất một phương pháp lặp nhanh sử dụng hình ảnh huỳnh quang tia X toàn cơ thể (XRF) để đánh giá một cách có hệ thống sự phân bố của NP trong cơ thể sống.

Chúng tôi đã áp dụng phương pháp này với NP gốc molypden và liposome chứa clodronate nhằm nhắm mục tiêu khối u kết hợp với việc làm suy giảm tạm thời đại thực bào, dẫn đến giảm tích tụ tại phổi và gan, và cuối cùng là phát hiện được khối u.

Chụp cắt lớp huỳnh quang tia X (XFCT) cung cấp cái nhìn sâu sắc 3 chiều về sự phân bố của NP bên trong khối u. Chúng tôi đã xác nhận kết quả bằng cách sử dụng phương pháp chụp ảnh đa thang với NP pha thuốc nhuộm, kết hợp với phân tích biểu hiện gen để lập hồ sơ độc tính nano.

Chụp ảnh XRF cho thấy tiềm năng lớn trong việc thúc đẩy các quy trình điều trị và chẩn đoán trong các nghiên cứu dược động học tiền lâm sàng.

Giới thiệu

Kỹ thuật sinh học lặp lại là một quy trình quan trọng trong việc thiết kế và tối ưu hóa hạt nano (NP) cho các ứng dụng y học, đặc biệt trong y học nano. Quá trình này bao gồm các bước: thiết kế, tổng hợp, đánh giá đặc tính và thử nghiệm tiền lâm sàng, lặp đi lặp lại theo phản hồi thực nghiệm. Việc thiết kế các NP dùng trong chẩn đoán hình ảnh cần xem xét các yếu tố như thành phần, kích thước và hình dạng, vì chúng ảnh hưởng mạnh đến phân bố trong cơ thể và độc tính. Ngoài ra, các đặc tính bề mặt như hóa học, độ ưa nước và điện tích cũng ảnh hưởng đến cách NP tương tác với cơ thể, quyết định khả năng hấp thụ vào tế bào, phản ứng sinh học, và khả năng đào thải. Sự tích tụ ngoài ý muốn của hạt nano (NP) trong các cơ quan như gan và phổi là một thách thức lớn trong y học nano. Mặc dù NP có tiềm năng cao trong chẩn đoán và điều trị, việc chúng bị giữ lại tại các cơ quan có thể gây tác dụng phụ, ảnh hưởng đến chức năng cơ quan và gây viêm, từ đó hạn chế ứng dụng lâm sàng.

Thêm vào đó, các nghiên cứu gần đây cho thấy chưa đến 1% NP được đưa thành công đến khối u đặc, do bị hệ thống thực bào đơn nhân giữ lại, góp phần làm giảm tỷ lệ ứng dụng lâm sàng. Do đó, việc đánh giá độc tính NP in vitro (trong ống nghiệm) là cần thiết nhưng chưa đủ để dự đoán tác động thực tế trong cơ thể sống. Quá trình thiết kế và tối ưu hóa NP phải trải qua nhiều bước thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo, làm tăng thời gian và chi phí phát triển. Trong bối cảnh đó, cần phát triển phương pháp nghiên cứu tiền lâm sàng nhanh và hiệu quả, giúp thu thập thông tin về phân bố sinh học, sự lưu giữ tại cơ quan chính và quá trình thải trừ của NP, từ đó nâng cao hiệu quả nhắm mục tiêu và giảm tác dụng phụ, góp phần thúc đẩy ứng dụng lâm sàng. Trong các nghiên cứu dược động học tiền lâm sàng in vivo, các phương pháp hình ảnh truyền thống như MRI, PET, và quang học thường được sử dụng. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những hạn chế riêng: độ đặc hiệu thấp, cần gắn chất phóng xạ, hoặc độ xuyên sâu kém (1, 13, 14). Ngoài ra, việc xác nhận sự phân bố và hiệu quả nhắm mục tiêu của hạt nano vẫn cần đến phân tích mô học tốn thời gian (15).

Gần đây, huỳnh quang tia X (XRF) đã được ứng dụng trong chụp ảnh in vivo ở động vật nhỏ với độ đặc hiệu nguyên tố cao, bằng cách thiết kế các hạt nano vô cơ làm chất tương phản, gồm các nguyên tố có cạnh hấp thụ phù hợp với năng lượng tia X (24 keV), như molypden (Mo), ruthenium (Ru) hoặc rhodium (Rh) (16–20).

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, cấu trúc nano lai nhân-vỏ, gồm lõi MoO₂ hoạt động XRF và vỏ silica pha thuốc nhuộm, đã cho phép kết hợp hình ảnh XRF và huỳnh quang quang học, đồng thời giảm độc tính tế bào in vitro so với MoO₂ không có vỏ (18). Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tiếp tục khai thác kỹ thuật sinh học lặp lại (iterative bioengineering) để đánh giá hiệu suất của hạt nano, từ đó nhanh chóng xác định các hướng cải tiến thiết kế, tạo ra các giải pháp hiệu quả và đa chức năng hơn.

Khái niệm và phương pháp tiếp cận lặp lại

Chúng tôi đã minh họa về mặt khái niệm phương pháp kỹ thuật sinh học lặp lại kết hợp với chụp ảnh huỳnh quang tia X (XRF) (Hình 1). Hình minh họa sơ đồ hệ thống chụp ảnh XRF in vivo (Hình 1A) cho thấy việc sử dụng chùm tia X hội tụ có năng lượng 24 keV, tạo ra bức xạ XRF khi kích thích các nguyên tố có cạnh hấp thụ phù hợp với năng lượng nguồn tia X (21).

Bức xạ không bị hấp thụ được sử dụng để chụp ảnh tia X thông thường (truyền qua), làm cơ sở tham chiếu không gian cho tín hiệu XRF. Một con chuột được gây mê được đặt lên giá đỡ thẳng đứng, di chuyển theo hướng x-y để thu ảnh chiếu, trong khi bàn xoay có thể quay để tạo ảnh cắt lớp huỳnh quang tia X (XFCT).

Trong nghiên cứu này, các hạt nano gốc molypden (Mo) được chọn làm tác nhân tương phản. Hai loại NP là MoO₂ và MoO₂-SiO₂ được nghiên cứu để đánh giá phân bố sinh học thông qua chụp ảnh XRF và kiểm tra tính tương thích sinh học.

Ngoài ra, nhằm giảm vai trò của các đại thực bào gan (tế bào Kupffer) trong việc giữ lại NP (8), chúng tôi đã tiêm trước liposome trống và liposome chứa clodronate để khảo sát ảnh hưởng của việc loại bỏ tạm thời tế bào Kupffer lên sự phân bố trong cơ quan và khả năng phát hiện khối u — nhờ tăng thời gian lưu thông của NP dẫn đến tích tụ nhiều hơn (Hình 1B).

Chụp ảnh XRF được sử dụng như một công cụ hỗ trợ kỹ thuật sinh học lặp lại trong việc phát triển các hạt nano làm chất tương phản. Nghiên cứu phân bố sinh học in vivo giúp nâng cao quá trình tối ưu hóa hạt nano và lựa chọn phương pháp phù hợp nhất để đạt được nhắm mục tiêu thụ động vào khối u, đồng thời giảm thiểu sự tích tụ không mong muốn tại các cơ quan như phổi và gan (Hình 1C).

Các hạt nano MoO₂ (MoO₂ NPs) được tổng hợp bằng phương pháp solvothermal, sử dụng polyvinylpyrrolidone (PVP) làm chất bao phủ bề mặt, tạo ra các cụm hình cầu nhỏ có đường kính 40 ± 12 nm, được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (Hình 2A và 2D).

Một lớp vỏ silica mỏng được tạo thành trên bề mặt các hạt MoO₂ bằng phương pháp Stöber cải tiến, sử dụng Cy5.5 làm chất phát huỳnh quang được pha tạp. Sơ đồ minh họa quá trình tổng hợp hai bước được trình bày trong Hình S1. Việc sử dụng lượng chất tiền silica thấp hơn so với báo cáo trước đây (18) tạo ra lớp vỏ mỏng hơn.

Các hạt MoO₂-SiO₂ NPs thu được có lớp phủ đồng đều (Hình 2B và 2C), với đường kính trung bình tổng thể (khi khô) là 55 ± 10 nm (Hình 2D). Chỉ số phân tán kích thước (PDI) cũng được sử dụng để đánh giá độ đồng đều kích thước của các hạt.

Kích thước thủy động học của các hạt cũng tương tự, lần lượt là 64 ± 18 nm (PDI = 0.12) đối với MoO₂ NPs và 73 ± 23 nm (PDI = 0.19) đối với MoO₂-SiO₂ NPs. Với PDI thấp và giá trị điện thế zeta âm mạnh (< –30 mV), các hạt cho thấy tính ổn định cao và độ phân tán thấp trong môi trường nước (Hình 2F), đáp ứng các yêu cầu quan trọng trong ứng dụng y sinh (22, 23).

Phân tích nhiễu xạ vùng chọn lọc (SAED) bằng TEM (Hình S2A) cung cấp thông tin về cấu trúc tinh thể của MoO₂ sau khi phủ silica: MoO₂-SiO₂ NPs cho thấy mẫu nhiễu xạ điển hình (Hình S2B) của MoO₂ với cấu trúc tinh thể lục giác, theo thẻ dữ liệu của Trung tâm Dữ liệu Nhiễu xạ Quốc tế (ICDD) số 00-050-0739, tương tự như các hạt MoO₂ ban đầu (18, 24). Điều này chứng minh rằng phương pháp Stöber cải tiến không làm thay đổi cấu trúc lõi của hạt nano.

Ethanolamine (EA) được sử dụng như một chất xúc tác mạnh, giúp tăng tốc độ phản ứng, từ đó giảm thời gian tiếp xúc của lõi MoO₂. Sự hình thành silica được xác nhận bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), với dao động kéo giãn Si–O–Si tại 1079 cm⁻¹ (Hình S3A) (26).

Ngoài ra, dải hấp thụ tại 1637 cm⁻¹, tương ứng với dao động kéo giãn C=O, xác nhận sự có mặt của PVP hóa hấp phụ qua nhóm carbonyl, được thể hiện qua sự dịch chuyển từ giá trị của PVP tự do trong nước (1632 cm⁻¹). Điều này cũng chứng tỏ rằng không có sự thay thế phân tử trên bề mặt lõi, và silica phát triển trên lớp PVP.

Tính chất huỳnh quang của MoO₂-SiO₂ NPs được xác nhận qua phổ kích thích và phát xạ quang phát quang (PL), với các đỉnh lần lượt tại 672 nm và 686 nm (Hình S3B). Các phổ này cho thấy quá trình pha tạp Cy5.5 vào vỏ silica đã thành công.

Các hạt MoO₂-SiO₂ tổng hợp được đánh giá in vitro về độc tính tế bào trên hai dòng tế bào, cho thấy khả năng sống sót phụ thuộc vào nồng độ (Hình S4A và S4B).

Chụp ảnh XRF và kỹ thuật sinh học lặp lại

Chúng tôi đã chứng minh vai trò của chụp ảnh huỳnh quang tia X (XRF) trong quy trình kỹ thuật sinh học lặp lại, bằng cách sử dụng các hạt MoO₂ và MoO₂-SiO₂. Hình ảnh được thu thập sau 1 giờ kể từ khi tiêm hạt nano.

Các hạt MoO₂ được đánh giá trong một nghiên cứu sơ bộ để xác nhận kết quả đã được quan sát trước đó (27): Chúng chủ yếu tích tụ tại phổi và gan, điều này có thể được quan sát qua ảnh chiếu, nơi tín hiệu XRF (Mo Kα) bám theo cấu trúc của phổi trong khoang ngực (Hình 3A và Hình S5).

Tín hiệu XRF tổng hợp giảm dần theo thời gian, được cho là do quá trình thải loại hạt nano ra khỏi cơ thể. Một lượng tín hiệu nhỏ cũng được phát hiện ở lách.

Lần lặp thứ hai bao gồm việc bổ sung lớp vỏ silica pha thuốc nhuộm, tạo ra các hạt MoO₂-SiO₂ NPs. Những con chuột được tiêm MoO₂-SiO₂ cho thấy sự phân bố sinh học khác biệt khi quan sát bằng chụp ảnh XRF (Hình 3B và Hình S6). Sau khi tiêm (1 giờ), ảnh chiếu XRF cho thấy tín hiệu XRF chủ yếu xuất hiện ở gan, được ghi nhận là con đường đào thải chính của các hạt nano có kích thước này (28, 29). Sự phân bố sinh học tổng thể không thay đổi đáng kể trong vòng 24 giờ, chỉ ghi nhận sự giảm tín hiệu XRF ở gan, cho thấy các hạt đã được bài tiết qua hệ thống gan – mật (28). Kết quả tương tự cũng được quan sát ở cả 4 con chuột được tiêm (Hình S6), với sự dao động nhẹ trong cường độ tín hiệu XRF, được cho là do sai số ngẫu nhiên trong quá trình tiêm. Thỉnh thoảng, tia XRF cũng được phát hiện tại bàng quang.

Các ảnh chiếu XRF từ chuột được tiêm liposome chứa clodronate và MoO₂-SiO₂ NPs cung cấp thông tin về mức độ ảnh hưởng của clodronate đến gan, và từ đó là tác động đến sự phân bố toàn thân (Hình 3C và Hình S7). Đáng chú ý, tín hiệu XRF phân tán được phát hiện trên toàn bộ cơ thể, bao gồm cả các mạch máu lớn như động mạch mắt và mô não. Mặc dù vẫn có tín hiệu ở phổi và gan, nhưng phần lớn tín hiệu (>70%) tập trung ở lách.

Ngoài ra, dấu hiệu lách to (splenomegaly) cũng được quan sát ở tất cả các con chuột được chụp. Khi giải phẫu, lá lách từ cả nhóm đối chứng và nhóm tiêm đều có kích thước lớn tương tự nhau (Hình S8A), với chiều dài lớn nhất vượt quá 2 cm. Quan sát này dẫn đến kết luận rằng lách to là do tế bào ung thư 4T1 được cấy ghép gây ra, vốn đã được biết là gây phản ứng giống bạch cầu (leukemoid reaction) với lách to ở chuột BALB/c (30).

Để so sánh, những con chuột không được cấy ghép khối u có lá lách nhỏ hơn (~1 cm), và điều này có thể được quan sát gián tiếp qua tín hiệu XRF (Mo Kα) theo hình dạng của lá lách (Hình S5).

Phát hiện khối u trong cơ thể sống (in vivo)

Chuột BALB/c được cấy ghép tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 cùng nguồn (syngeneic). Loại khối u này đặc trưng bởi sự phát triển nhanh tại chỗ và di căn trong vòng 3 đến 4 tuần (31). Mục tiêu của chúng tôi là phát hiện khối u rắn nguyên phát, vốn có mức tăng trưởng theo cấp số nhân (R² = 0.9913), được đo bằng cách sờ nắn và ước lượng theo công thức hình elip (Hình S9A), xác nhận tốc độ tăng trưởng phù hợp với các nghiên cứu trước đó (32).

Chuột được tiêm liposome chứa clodronate trong vòng 13 ngày kể từ khi cấy ghép khối u; các khối u đạt thể tích ít nhất 400 mm³, tương ứng với điểm cuối của các đường cong tăng trưởng (Hình S9B).

Sau khi tiêm MoO₂-SiO₂ NPs vào những con chuột đã bị loại bỏ đại thực bào, chúng tôi theo dõi sự phân bố sinh học theo thời gian. Quá trình này được đặc trưng bởi sự tích tụ dần dần của hạt nano trong lách và ở mức độ thấp hơn là gan, trong khi tín hiệu phân tán ở các cơ quan khác giảm dần (Hình 4A và Hình S7).

Ở những con chuột này, tín hiệu XRF của molypden (Mo) đã có thể phát hiện trong khối u chỉ sau 6 giờ tiêm, và đạt đỉnh điểm sau 24 giờ.

Kỹ thuật chụp cắt lớp XRF (XFCT) tại vùng khối u rắn cung cấp hình ảnh 3 chiều của sự phân bố hạt nano trong khối u, với mức tích tụ cao nhất nằm ở trung tâm khối u (Hình 4B).

Việc phát hiện khối u chỉ trở nên khả thi nhờ vào quy trình cải tiến sinh học lặp đi lặp lại, dẫn đến quyết định kết hợp tiêm cả liposome chứa clodronate và MoO₂-SiO₂ NPs, được hỗ trợ bởi kỹ thuật chụp ảnh XRF.

Phù hợp với các nghiên cứu trước, hiệu ứng tăng tính thấm và giữ lại (EPR) không đủ để phát hiện khối u (Hình S6), vì hiệu ứng này thường chỉ giúp vận chuyển dưới 1% hạt nano vào khối u rắn (8, 33, 34).

Hình ảnh đa cấp độ và độc tính nano

Chất phát huỳnh quang (Cy5.5) có trong lớp vỏ silica của hạt nano MoO₂-SiO₂ cho phép theo dõi các hạt nano trong các lát cắt mô bằng kính hiển vi huỳnh quang quang học, từ đó cung cấp khả năng xác thực lại các quan sát phân bố sinh học từ ảnh XRF. Các bước sóng kích thích và phát xạ cao của Cy5.5 được gắn trong MoO₂-SiO₂ NPs (hình S3B) giúp giảm thiểu hiện tượng huỳnh quang nội tại của mô trong các phân tích sau mổ (35).

Phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch và nhuộm màu bằng enzyme (chromogenic) đã được thực hiện trên gan và lách đã tách rời để đối chiếu kết quả phân bố thu được từ ảnh XRF với quan sát dưới kính hiển vi (Hình 5 và các hình S10, S11).

Hình ảnh hiển vi đồng tiêu (confocal) của mô gan từ các con chuột được tiêm liposome rỗng và MoO₂-SiO₂ NPs cho thấy hoạt động thực bào của các tế bào Kupffer. Các tế bào này được nhuộm bằng kháng thể F4/80 — nhận diện glycoprotein bề mặt tế bào có mặt trên đại thực bào — kết hợp với chất phát huỳnh quang (Alexa Fluor 488). Hạt nano có thể được xác định vị trí trong bào tương của đại thực bào thông qua phát hiện Cy5.5 (Hình 5A và 5B).

Sự hiện diện của các tế bào Kupffer rải rác trong nhu mô gan cũng được xác nhận thông qua phương pháp nhuộm miễn dịch chromogenic (Hình 5C).

Giảm rõ rệt sự xâm nhập của đại thực bào được quan sát thấy trong các lát mô gan của những con chuột được tiêm liposome chứa clodronate (hình S10C), so với lát gan của chuột đối chứng không tiêm (hình S10E) và chuột được tiêm liposome rỗng (hình S10A). Sự giảm đáng kể trong tín hiệu XRF được phát hiện tại gan giữa các nhóm chuột được tiêm liposome rỗng (hình S5) và liposome chứa clodronate (hình S6) phản ánh ở việc giảm phát hiện huỳnh quang quang học (Cy5.5) ở nhóm sau (hình S10D).

Miễn dịch huỳnh quang (hình 5D và hình S11) và nhuộm miễn dịch chromogenic (hình 5F) trên mô lách cho phép xác định vị trí của các tế bào dòng tủy (bao gồm cả đại thực bào ở lách), phân bố đồng đều trong vùng tủy đỏ, được bao quanh bởi tế bào lưới và lympho bào (36). Nhiều hồng cầu tự phát huỳnh quang được tìm thấy trong tủy đỏ (hình 5D và 5E). Đại thực bào ở lách chứa các hồng cầu trong bào tương, là kết quả của hiện tượng thực bào hồng cầu do thoát mạch hoặc tổn thương (37). Các hồng cầu có thể được phân biệt rõ với đại thực bào nhờ hình dạng đặc trưng.

Hạt nano MoO₂-SiO₂ có thể được theo dõi thành công trong lách của chuột được tiêm, với việc phát hiện thường xuyên trong vùng tủy đỏ của chuột đã được tiêm trước liposome chứa clodronate (hình 5D và 5E), và sự tích tụ chỉ xuất hiện lẻ tẻ ở nhóm không tiêm clodronate (hình S11B), phù hợp với các quan sát đại thể từ ảnh XRF.

Phân tích biểu hiện gen ở gan và lách cho thấy hạt nano MoO₂-SiO₂ chỉ gây ra những thay đổi nhỏ so với chuột đối chứng không tiêm (hình 5G và bảng S1). Khi được tiêm trước clodronate, mức độ biểu hiện gen trong gan tăng đáng kể, trong khi biểu hiện gen ở lách ít bị ảnh hưởng. Quan sát này cho thấy xu hướng ngược lại so với sự tái phân bố tích tụ hạt nano (từ gan chuyển sang lách).

KẾT LUẬN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã giới thiệu một phương pháp luận nhằm tăng tốc độ lặp lại trong việc đánh giá tiền lâm sàng các chất tương phản, sử dụng XRF/XFCT làm phương pháp chẩn đoán hình ảnh. Quá trình thiết kế tuần tự các hạt nano (NP) đã giúp tối ưu hóa giao thức tiêm NP, từ đó ngăn chặn việc tích tụ hạt ở các cơ quan không mong muốn như gan và phổi, đồng thời cho phép đưa NP đến các khối u xenograft một cách thụ động và chẩn đoán hiện tượng lách to – một phản ứng sinh học do khối u gây ra. Hình ảnh XRF đã thể hiện được dược động học và sự tái phân bố của NP trong cơ thể sống, không gặp hiện tượng nhiễu do tự phát huỳnh quang và không bị giới hạn bởi độ xuyên thấp – những hạn chế thường gặp trong chụp huỳnh quang quang học (38).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô hình chuột đồng gen (syngeneic), nhằm bảo tồn hệ miễn dịch còn nguyên vẹn. Việc dùng các mô hình này cho phép điều tra sự phân bố sinh học của NP trong điều kiện có hệ miễn dịch đầy đủ. Cách tiếp cận này giúp đưa ra các dự đoán đáng tin cậy hơn về tương tác của thuốc nano trong cơ thể (15, 39, 40).

Lần lặp đầu tiên là nghiên cứu sự phân bố sinh học của NP MoO₂. Dù không quan sát thấy thay đổi hành vi hay biểu hiện bệnh lý ở chuột, các nghiên cứu mô học trước đây trên các cơ quan chiết xuất cho thấy sự hiện diện của cục máu đông tại chỗ ở chuột được tiêm NP MoO₂ (27), có thể liên quan đến sự tích tụ NP ở phổi – điều đã được phát hiện thành công bằng chụp ảnh phân tử XRF. Khả năng theo dõi chất tương phản tại phổi bằng XRF là một lợi thế lớn so với MRI – kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh lâm sàng tiêu chuẩn nhưng lại có ứng dụng hạn chế cho phổi do hiện tượng nhiễu gây ra bởi giao diện không khí – mô (41, 42). Về mặt này, độ nhạy đối với NP MoO₂ đã được ước tính ở mức khoảng 10⁻² mg/ml (27), và các chất tương phản đa phương thức cho thấy độ nhạy tương tự giữa XFCT và MRI có tăng cường tương phản (42).

Nhằm cải thiện khả năng tương thích sinh học và phân bố sinh học của NP, một lớp vỏ silica có pha thuốc nhuộm đã được đưa vào, tạo thành NP MoO₂-SiO₂. Các hạt này đã chứng minh độc tính thấp hơn so với NP MoO₂ nguyên bản trong các thử nghiệm in vitro; ngoài ra, thuốc nhuộm Cy5.5 được nhúng vào lớp vỏ silica để cho phép chụp ảnh huỳnh quang quang học (18). Ở đây, chúng tôi đã cung cấp bằng chứng cho thấy lớp vỏ silica ảnh hưởng đáng kể đến phân bố sinh học, thông qua hình ảnh XRF ở chuột được tiêm MoO₂-SiO₂ NP – trước đó được tiêm phúc mạc với liposome rỗng làm đối chứng cho vòng lặp tiếp theo. Việc các hạt di chuyển từ phổi đến gan được cho là do bản chất dạng cụm của NP MoO₂ nguyên bản, dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH và độ mặn. Ngược lại, NP MoO₂-SiO₂ được phủ một lớp silica vô định hình đồng đều, với các nhóm hydroxyl tích điện âm giúp ngăn chặn sự kết tụ thêm.

Sự giữ lại của NP tại gan là một trong những rào cản sinh học chính, có thể tích tụ tới 99% liều tiêm, ngăn cản việc đưa thuốc nano đến vị trí đích mong muốn (43, 44). Nhiều nghiên cứu với các loại NP vô cơ khác nhau cho thấy rằng chúng chủ yếu bị hấp thu bởi các tế bào không thuộc nhu mô gan như đại thực bào gan (tế bào Kupffer) và tế bào nội mô xoang gan, hơn là bởi các tế bào gan chính (hepatocyte) (44). Hơn nữa, dòng chảy trong hệ mao mạch gan cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp thu NP (29). Vì lý do đó, bước thứ ba trong quá trình lặp lại của chúng tôi tập trung vào việc đưa vào các liposome chứa clodronate, nhằm mục tiêu làm cạn tạm thời các tế bào Kupffer (45, 46) trước khi tiêm NP. Tế bào Kupffer được biết là tương tác với các NP tuần hoàn, dẫn đến hiện tượng giữ lại (47), và việc loại bỏ chúng đã cho phép phát hiện khối u. Sau khi loại bỏ đại thực bào, lách trở thành rào cản chính, điều này phù hợp với các quan sát trước đó khi dùng NP vàng và NP SiO₂ (48). Dù đã loại bỏ đại thực bào, các NP với kích thước tăng lên do hình thành lớp corona protein có thể đã bị giữ lại một phần trong tủy đỏ, thông qua quá trình lọc tại lách (49). Trong trường hợp của chúng tôi, hiện tượng giữ lại gia tăng tại lách cũng có thể liên quan đến hiện tượng lách to do khối u gây ra.

Cách tiếp cận hình ảnh đa thang đã cho phép kết hợp giữa quan sát từ kính hiển vi confocal với nghiên cứu phân bố sinh học bằng XRF, qua đó xác nhận tính hiệu quả của phương pháp lặp lại mà chúng tôi đề xuất cho các nghiên cứu tiền lâm sàng. Ngoài ra, để hiểu sâu hơn về ảnh hưởng của sự tái phân bố NP đến hai cơ quan chính (gan và lách), chúng tôi đã định lượng biểu hiện của một số gen liên quan đến các con đường tế bào được kích hoạt khi tiếp xúc với NP, như viêm, stress oxy hóa và chết tế bào theo chương trình (apoptosis). Việc tiêm trước clodronate đã làm tăng biểu hiện của nhiều gen được kiểm tra, cho thấy sự cạn kiệt tạm thời tế bào Kupffer có thể đã làm mất cân bằng nội môi của gan, dẫn đến tăng độc tính gan. Đáng chú ý, việc phân tích biểu hiện gen được thực hiện 24 giờ sau khi tiêm NP MoO₂-SiO₂, cho thấy một giai đoạn phản ứng cấp tính – có khả năng sẽ suy giảm sau khi NP được thải ra khỏi cơ thể, giống như những gì đã quan sát trước đó với các chất tương phản NP khác (50). Phần thảo luận chi tiết hơn được trình bày trong Tài liệu Bổ sung.

Tóm lại, thông qua quy trình lặp lại nhanh trong kỹ thuật sinh học này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của hóa học bề mặt (MoO₂ so với MoO₂-SiO₂) và việc loại bỏ đại thực bào đến sự phân bố sinh học của NP mà không cần đến các phương pháp xâm lấn hay mổ xác. Độ đặc hiệu và độ nhạy cao đã cho phép phát hiện thành công tín hiệu XRF của molypden với độ phân giải dưới milimet ở nhiều cơ quan khác nhau, nhấn mạnh tiềm năng ứng dụng của XRF/XFCT trong các nghiên cứu tiền lâm sàng về dược động học đối với các công thức thuốc dựa trên công nghệ nano.

MATERIALS AND METHODS

Vật liệu

Ammonium heptamolybdat [AHM; (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O], PVP (55 kDa), Cy5.5 mono NHS ester (Cy5.5-NHS), (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES; C₉H₂₃NO₃Si, 99%), triethylamin (TEA; C₆H₁₅N, ≥99%), dimethyl sulfoxide (DMSO; C₂H₆OS·H₂O, ≥99%), tetraethyl orthosilicate (TEOS; C₈H₂₀O₄Si ≥ 99%), và EA (C₂H₇NO, ≥99%) đều được mua từ Sigma-Aldrich (Stockholm, Thụy Điển). Ethanol (EtOH) tuyệt đối (≥99,8%) được mua từ VWR (Stockholm, Thụy Điển). Hệ thống lọc nước MilliQ reference (Merck Millipore) được sử dụng để tạo nước khử ion (DI). Liposome chứa clodronate và liposome rỗng (đối chứng) được mua từ Liposoma BV (Amsterdam, Hà Lan).

Tổng hợp hạt nhân (Core NP synthesis)

Các hạt nano MoO₂ (MoO₂ NPs) được tổng hợp bằng phương pháp nhiệt dung môi (solvothermal) (18). Tiền chất AHM (3,6 mM) được hòa tan trong 54 ml nước khử ion (DI) và 24 ml ethanol (EtOH). PVP (0,29 mM) được thêm vào, sau đó khuấy trong 30 phút. Quá trình tổng hợp được thực hiện ở 180°C trong 18 giờ bằng nồi phản ứng thép không gỉ có lớp lót Teflon (hình S1A). Các hạt nano MoO₂ thu được được rửa bằng cách ly tâm và phân tán lại trong nước khử ion.

Liên hợp thuốc nhuộm (Dye conjugation)

Cy5.5-NHS được liên hợp với APTES để cho phép pha tạp chất huỳnh quang vào lớp vỏ silica trong quá trình phản ứng ngưng tụ (51). Cy5.5-NHS (1 mg), APTES (0,3 μl) và TEA (0,2 μl) được phân tán trong DMSO (50 μl) và khuấy trong 24 giờ, cuối cùng thu được Cy5.5-APTES.

Ngưng tụ lớp vỏ silica (Silica shell condensation)

Phương pháp Stöber đã được điều chỉnh, sử dụng EA làm bazơ, được áp dụng như đã báo cáo trước đó trong tài liệu (18, 25), với một vài thay đổi. Trong hỗn hợp nước/EtOH (tỷ lệ 1/3,75), các hạt nano MoO₂ được phân tán (0,25 mg/ml trong tổng thể tích 19 ml). TEOS (10 μl) được thêm vào, và hỗn hợp được khuấy trong 30 phút. Cy5.5-APTES (1 μl) và EA (200 μl) được bổ sung và tiếp tục khuấy trong 2 giờ. Các hạt nano MoO₂-SiO₂ thu được được rửa bằng cách ly tâm với EtOH (1 lần) và nước (1 lần), sau đó phân tán trong nước và bảo quản ở 4°C (hình S1B).

Kỹ thuật đặc trưng vật liệu

Điện tích bề mặt (zeta-potential) và kích thước phân bố động học [tán xạ ánh sáng động (DLS)] được đo trong nước (pH 6,5) bằng hệ thống Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, Anh). Giá trị kích thước DLS được báo cáo là giá trị trung bình theo số lượng hạt. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEM-2100F, 200 kV, JEOL) được sử dụng để đánh giá hình thái và kích thước của các hạt nano (NP) sau khi làm khô. Lưới đồng được sử dụng bằng cách nhỏ 10 μl mẫu lên, sau đó để khô ở nhiệt độ phòng. Đối với phân tích kích thước bằng TEM, ít nhất 350 hạt NP hoặc cụm hạt từ các vùng quan sát khác nhau đã được đo. Quang phổ huỳnh quang (PL) được phân tích bằng thiết bị spectrofluorometer (FP-8300, Jasco) để xác định các tính chất huỳnh quang của hạt nano nhân-lõi vỏ (core-shell). Pha tinh thể được xác định bằng nhiễu xạ điện tử vùng chọn (SAED) trong TEM. Sự hiện diện của PVP và SiO₂ được xác nhận bằng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR, Thermo Fisher Scientific). Thử nghiệm Limulus Amebocyte Lysate (LAL) bằng hệ thống Endosafe-PTS (Charles River) và hộp thử PTS [độ nhạy 0,005 đơn vị nội độc tố (EU)/ml] được sử dụng để kiểm tra sự nhiễm lipopolysaccharide (LPS) trong các dung dịch NP. Tất cả các dung dịch được sử dụng cho nghiên cứu in vitro và in vivo đều có hàm lượng LPS dưới giới hạn cho phép tối đa là 0,1 EU/ml. Nồng độ molypden (Mo) được ước tính bằng huỳnh quang tia X (XRF, Mo Kα) bằng cách chuẩn bị các dung dịch phân tán MoO₂ NP và MoO₂-SiO₂ NP pha loãng 10 lần. Dung dịch chuẩn Mo [1000 phần triệu (ppm)] và nước (trong thể tích 2 ml) được sử dụng làm mẫu chuẩn và để loại bỏ tín hiệu nền.

Thử nghiệm độc tính tế bào

Để đánh giá khả năng tương thích sinh học in vitro của hạt nano (NP), thử nghiệm phân tích tế bào thời gian thực (xCELLigence Agilent, St. Clara, Hoa Kỳ) đã được thực hiện trên hai dòng tế bào RAW264.7 (ATCC-TIB-71) và 4T1 (ATCC-CRL-2539) ở hai nồng độ (200 và 100 ppm), với ba lần lặp lại sinh học (đĩa 96 giếng). Các tế bào không xử lý được sử dụng làm đối chứng âm. Khả năng sống của tế bào được ước tính dựa trên sự đo lường trở kháng, một chỉ số phản ánh sự tăng sinh của tế bào. Các tế bào được cho bám vào bề mặt đĩa trong 24 giờ trước khi thêm hạt nano (thời điểm = 0). Tín hiệu được chuẩn hóa so với nhóm tế bào đối chứng tại mỗi thời điểm (±SD).

Thử nghiệm trên động vật

Các thí nghiệm trên chuột được phê duyệt bởi Ủy ban đạo đức động vật khu vực Bắc Stockholm, Thụy Điển (giấy phép đạo đức số 13156-2022), theo các hướng dẫn của tổ chức, quốc gia và châu Âu về chăm sóc và nghiên cứu động vật (L150/SJVFS 2019:9 và 2010/63/EU). Chuột cái bạch tạng BALB/cAnNRj, 8 tuần tuổi, được cung cấp bởi Janvier Labs (Pháp) và được nuôi dưỡng trong điều kiện kiểm soát nhiệt độ (21° ± 1°C) và độ ẩm (55 ± 5%), với chu kỳ sáng-tối và được cho ăn tự do.

Tình trạng tổng quát của chuột được đánh giá trước và trong quá trình nghiên cứu, nhằm phát hiện sớm các thay đổi hành vi và/hoặc hình thái. Trọng lượng của chuột được theo dõi trong suốt thời gian nghiên cứu, với mức dao động không vượt quá 15% (hình S8B).

Trong một nghiên cứu sơ bộ, hai con chuột được tiêm tĩnh mạch các hạt nano MoO₂ (100 μl, 20 mg/kg) và được cho an tử sau 1 tuần để xác nhận các kết quả trước đó (27). Trong nghiên cứu chính, tám con chuột được ghép mô ung thư bằng cách tiêm dưới da dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 đồng gen (1×10⁶ tế bào, được treo trong 100 μl dung dịch đệm phosphate – PBS). Dòng tế bào khối u này có đặc điểm là phát triển nhanh tại chỗ, tạo thành khối u có thể sờ thấy khoảng 0,5 cm³ trong vòng 13 ngày.

Chuột mang khối u sau đó được tiêm phúc mạc liposome chứa clodronate (n = 4) hoặc liposome rỗng (n = 4), được phân tán trong PBS (200 μl, 40 mg/kg). Sau 72 giờ, các hạt nano MoO₂-SiO₂ được tiêm tĩnh mạch (100 μl, 30 mg/kg) vào những con chuột này.

Chụp ảnh XRF

Ảnh chiếu XRF và quét cắt lớp XRF (XFCT) được thu nhận trong cơ thể sống với hệ thống hình ảnh được mô tả chi tiết trong Tài liệu Bổ sung. Các lần quét được thực hiện dưới gây mê bằng isoflurane (Abbott, Thụy Điển) tại nhiều thời điểm khác nhau. Trong suốt các phiên chụp, thuốc mỡ nhỏ mắt (Oculentum simplex, APL, Thụy Điển) được bôi lên mắt để bảo vệ giác mạc; đồng thời, nhiệt độ cơ thể và nhịp thở của chuột cũng được theo dõi.

Đối với chụp ảnh chiếu XRF toàn thân, bước quét là 200 μm và thời gian phơi sáng mỗi bước là 10 mili giây, dẫn đến tổng thời gian quét khoảng 15 phút. Chụp cắt lớp XFCT tại vùng khối u (vùng chiều cao 1 cm) được thực hiện với kích thước voxel là 200 μm × 200 μm × 400 μm, ghi nhận 30 góc chiếu trong khoảng 180°, với tổng thời gian quét là 45 phút. Liều bức xạ trung bình ước tính là 1 mGy cho ảnh chiếu toàn thân và 22 mGy cho chụp cắt lớp XFCT cục bộ (27).

Phân tích mô học (Histological analysis)

Tại thời điểm kết thúc chụp ảnh, chuột được cho an tử bằng cách hít khí carbon dioxide (CO₂). Gan, lách và khối u được lấy ra và cố định trong dung dịch paraformaldehyde (PFA) đệm 4% trong vòng 24 giờ, theo quy trình chuẩn bị mô học (52). Tóm tắt quy trình như sau: sau 24 giờ cố định trong dung dịch PFA, các cơ quan được chuyển sang dung dịch ethanol 70% để bảo quản, trước khi tiến hành xử lý hút chân không và đúc trong paraffin.

Các lát cắt mô dày 4 μm được thu nhận bằng máy vi phẫu quay và gắn lên lam kính tiêu chuẩn. Các lát cắt mô cố định bằng formaldehyde và nhúng paraffin (FFPE) được xử lý tự động để loại bỏ paraffin và tái ngậm nước nhằm đánh giá hình thái học. Một mẫu mô tươi đại diện nhỏ từ các cơ quan cũng được thu thập trong thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Hoa Kỳ) và được bảo quản lạnh để chiết tách RNA trước khi cố định bằng PFA.

Nhuộm huỳnh quang miễn dịch (sử dụng Alexa Fluor 488) và nhuộm màu enzyme [3,3′-Diaminobenzidine (DAB)] cho đại thực bào được thực hiện trên các lát cắt FFPE, sử dụng kháng thể F4/80. Hình ảnh được thu nhận bằng kính hiển vi quét laser Zeiss LSM800-Airy (Carl Zeiss GmbH, Đức) với hai tia laser hoạt động ở bước sóng 488 và 640 nm cùng các bộ lọc phát xạ. Hai loại vật kính được sử dụng để thu hình ảnh (10× không khí, 63× nước). Các lát cắt nhuộm màu enzyme được quét bằng kính hiển vi quang học, và hình ảnh thu được được đánh giá bằng nền tảng web Cytomine (Cytomine Corporation SA, Bỉ).

Phân tích biểu hiện gen

RNA được tách chiết từ mô gan sau khi chuột được cho an tử, sử dụng bộ kit tách RNA (Zymo Research, California, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng và nồng độ RNA được đánh giá bằng điện di mao quản sử dụng thiết bị Agilent Bioanalyser 2100 (Agilent), trước khi tiến hành tổng hợp cDNA (AzuraQuant).

Biểu hiện của các gen liên quan đến viêm, stress oxy hóa và quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) được đánh giá (với ba lần lặp lại) bằng phản ứng PCR phiên mã ngược định lượng (qRT-PCR), sử dụng thuốc thử AzuraView GreenFast PCR (Azura Genomics, Hoa Kỳ) và bảng mồi PCR thiết kế riêng (RealTimePrimers, Elkin Park PA, Hoa Kỳ). Các gen được thử nghiệm được tóm tắt trong bảng S1.

Biểu hiện gen được ước tính bằng phương pháp Livak (53). Giá trị ΔCT được tính bằng cách chuẩn hóa biểu hiện của từng gen so với các gen nội chuẩn (housekeeping genes), và ΔΔCT được tính bằng cách chuẩn hóa giá trị ΔCT của mẫu tiếp xúc với hạt nano so với mẫu đối chứng không xử lý. Dữ liệu về biểu hiện gen được biểu diễn dưới dạng log fold change so với nhóm đối chứng (chuột không được tiêm).

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về biểu hiện gen trong gan và lách giữa nhóm chuột được tiêm trước liposome rỗng và nhóm được tiêm trước liposome chứa clodronate được xác định bằng phép kiểm định t của Student.