Màng sinh học là những thực thể động học nội tại liên tục thích nghi với các đặc tính sinh lý và tổ chức phân tử của chúng để hỗ trợ chức năng tế bào. Các kỹ thuật kính hiển vi hiện tại có thể thu được thông tin cấu trúc có độ phân giải cao của các phân tử được gắn nhãn nhưng việc định lượng hành vi nhớt đàn hồi liên quan với độ chính xác nanomet vẫn còn là một thách thức. Ở đây, chúng tôi phát triển một phương pháp dựa trên kính hiển vi lực nguyên tử kết hợp với các bộ truyền động nano nhanh để lập bản đồ phản ứng nhớt đàn hồi của các màng được hỗ trợ không gắn nhãn với độ phân giải không gian nanomet. Trên màng chất lỏng, chúng tôi chứng minh rằng phương pháp này có thể định lượng các biến thể cục bộ trong tính di động phân tử của lipid và thu được hệ số khuếch tán. Chúng tôi xác nhận phương pháp thực nghiệm của mình bằng các mô phỏng động lực học phân tử, đồng thời làm nổi bật vai trò của nước tại giao diện với màng trong phép đo. Việc thăm dò các lớp kép mô hình ba thành phần cho thấy mối tương quan không gian trong quá trình khuếch tán cục bộ trên các khoảng cách ≈20 nm trong các miền không có trật tự của chất lỏng. Mối tương quan bên này được tăng cường trong các màng thủy tinh thể bò bản địa, trong đó việc đưa vào các miền giàu protein gây ra sự thay đổi gấp bốn lần trong hệ số khuếch tán trên < 100 nm của các vùng chất lỏng, phù hợp với chức năng sinh học. Phát hiện của chúng tôi cho thấy sự khuếch tán được tập trung nhiều ở màng sinh học chất lỏng.
Giới thiệu
Màng lipid đóng vai trò quan trọng trong chức năng tế bào; chúng tạo ra một rào cản với môi trường bên ngoài, phân chia các bào quan và chứa các protein cần thiết cho quá trình vận chuyển, truyền tín hiệu và cảm biến 1 . Bản thân lipid, không chỉ tạo thành một ma trận màng thụ động, mà còn là những thành phần tích cực trong bộ máy tế bào. Chúng điều chỉnh chức năng protein màng 2 và quá trình gấp 3 , đóng vai trò trung tâm trong quá trình vận chuyển và lưu trữ chất béo và cholesterol khắp cơ thể 4 , và cung cấp các con đường dẫn truyền cho các ion và proton 5 , 6 , 7 . Các quá trình này phụ thuộc vào khả năng tổ chức lại cục bộ thành phần phân tử và các đặc tính sinh lý của màng tùy thuộc vào nhiệm vụ đang thực hiện. Các lực và động lực cục bộ liên quan đến điều này không hề tầm thường do môi trường đông đúc về mặt phân tử của màng 8 , 9 , 10 , 11 . Theo kinh nghiệm, việc theo dõi tại chỗ khả năng di chuyển ở quy mô của chính các lipid là một thách thức, vì chúng nhạy cảm với những thay đổi nhỏ nhất về nhiệt độ, hàm lượng ion, dòng chất lỏng bên ngoài và tương tác với chất nền 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Do lipid đóng vai trò trực tiếp trong việc tổ chức màng bên của cả màng động vật có vú 9 , 18 , 19 , 20 và màng vi khuẩn 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , nên bất kỳ bức tranh hợp lệ nào cũng phải chứa cả lực trong mặt phẳng và động lực học kết quả, cũng như tính không đồng nhất bên ở quy mô của một vài phân tử.
Hầu hết các nghiên cứu cho đến nay đều dựa vào tính di động của phân tử thu được thông qua các phép đo trung bình trên các diện tích màng tương đối lớn bao gồm hơn 106 phân tử. Các kỹ thuật như phục hồi huỳnh quang sau khi tẩy trắng bằng ánh sáng (FRAP) và quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS) 26 , 27 , 28 theo dõi chuyển động trung bình của thuốc nhuộm huỳnh quang trong các khu vực từ hàng chục đến hàng trăm micron vuông, do đó cung cấp một bức tranh vĩ mô khá gián tiếp về tính di động của phân tử. Điều này được định lượng bằng hệ số khuếch tán trung bình, D , đo độ dịch chuyển bình phương trung bình của các phân tử trên một đơn vị thời gian 29 . Các giá trị điển hình của D nằm trong khoảng từ 1-10 µm 2 s –1 đối với các màng được hỗ trợ (xem Ghi chú bổ sung 1.1 để biết tóm tắt về các giá trị tiêu biểu). Các kỹ thuật quang học phân tử đơn lẻ 30 , 31 , 32 , 33 , 34 có thể cung cấp các phép đo tính di động với độ phân giải không gian cao tới 10-20 nm, nhưng chúng dựa vào việc dán nhãn huỳnh quang cẩn thận đối với phân tử quan tâm và bị giới hạn về mặt thời gian. Hơn nữa, các kỹ thuật huỳnh quang có thể đưa ra những kết luận trái ngược nhau về mức độ sắp xếp màng 35 , với bản thân thuốc nhuộm có khả năng ảnh hưởng đến phép đo. Ngay cả việc sử dụng một giá trị riêng lẻ của hệ số khuếch tán cũng ngầm giả định chuyển động phân tử Brown diễn ra tốt, trái ngược với môi trường đông đúc của màng tế bào, nơi các chế độ khuếch tán không phải Brown (bất thường) thường là chuẩn mực 10 , 11 . Với tư duy này, một số nghiên cứu đã cố gắng định lượng các đặc tính nhớt đàn hồi của màng lipid mô hình 36 , nhưng các báo cáo về hành vi phi Newton vẫn còn gây tranh cãi 37 với những hạn chế thực nghiệm làm dấy lên nghi ngờ về kết quả.
Để mô tả đầy đủ các lực nhớt đàn hồi cục bộ và động lực phân tử kết quả của màng sinh học, các thang đo không gian và thời gian thích hợp sau đó phải được thẩm vấn đồng thời, với các phép đo cơ học cung cấp một sự kiểm soát trực tiếp các lực. Trên thực tế, điều này ngụ ý nhu cầu về độ phân giải không gian nanomet và độ phân giải thời gian microgiây, tất cả trong khi hoạt động tại chỗ, tại chỗ và trên các màng chưa sửa đổi. Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) cung cấp độ phân giải không gian phù hợp, với việc sử dụng đầu dò sắc nét nanomet giúp có thể lập bản đồ màng và tế bào sống tại chỗ, thu thập các chi tiết dưới phân tử 5 , 38 . Tuy nhiên, điều này trái ngược với độ phân giải thời gian của AFM, thường ở cấp độ giây. Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực này đã mở ra lĩnh vực mili giây 39 , 40 , với các phép đo microgiây có thể theo hướng vuông góc với mẫu 41 và phụ thuộc vào độ tương phản địa hình được mô tả rõ. Điều này cho phép hình dung chi tiết về động lực chuyển động của protein, nhưng việc không có cảm biến bên ngăn cản việc theo dõi động lực lipid xung quanh. Ở đây chúng tôi giải quyết những hạn chế này trong bối cảnh phép đo nhớt đàn hồi bằng cách kết hợp AFM với bộ truyền động trong mặt phẳng nhanh được thiết kế riêng. Điều này cho phép chúng tôi thực hiện các phép đo nano-rheological tần số cao trên màng sinh học chất lỏng mô hình và bản địa trong dung dịch với thang thời gian xuống tới 20 µs. Chúng tôi thu được hình ảnh có độ phân giải cao trong điều chế biên độ 42 và sau đó định lượng các lực nhớt đàn hồi cục bộ. Chúng tôi chứng minh rằng có thể theo dõi động lực phân tử bên trong màng chất lỏng qua ba cấp độ lớn về vận tốc trong khi vẫn giữ được độ phân giải không gian của các phép đo AFM truyền thống. Điều quan trọng là phương pháp này dựa vào biên độ cắt nhỏ của bộ truyền động, khiến kỹ thuật này vốn có độ phân giải cao và dễ triển khai trên hầu hết các AFM thương mại mà không cần thiết bị chuyên dụng. Mô phỏng động lực phân tử (MD) của quá trình đo xác thực phương pháp tiếp cận thực nghiệm và cung cấp thêm thông tin chi tiết về sự tương tác giữa tính di động của phân tử trong màng và trong lớp nước liền kề.
Nguyên lý của kỹ thuật
Việc dựa vào hình ảnh AFM thông thường để theo dõi độ linh động của phân tử là không thực tế đối với lipid chuyển động, xét đến kích thước và vận tốc khuếch tán của chúng, đặc biệt nếu mục tiêu là hoạt động tại chỗ và trong các điều kiện có liên quan đến sinh học. Thay vào đó, phương pháp của chúng tôi điều chỉnh AFM để hoạt động hiệu quả như một máy đo độ nhớt nano 43 , 44 , 45 , 46 : một dao động cắt ngang nhỏ (< 7 nm) được áp dụng cho mẫu và được đầu dò thăm dò tại chỗ. Sự kết hợp giữa mẫu dao động và đầu dò đạt được thông qua nhóm nhỏ các phân tử nằm ngay dưới đỉnh đầu dò (102 –10 3 trong trường hợp lipid). Do đó, lực cắt (trong mặt phẳng) và độ lệch pha dao động được đo bằng đầu dò chứa thông tin trực tiếp về hành vi nhớt đàn hồi của phân tử, bản thân nó liên quan đến độ linh động của phân tử. Để đạt được vận tốc cắt có liên quan trong khi vẫn duy trì tính cục bộ ở quy mô nano (biên độ nhỏ), cần có tần số cắt cao. Điều này không thể thực hiện được với AFM tiêu chuẩn do tần số khối lượng và cộng hưởng của các bộ phận chuyển động 46. Thay vào đó, chúng tôi sử dụng bộ truyền động cắt nhỏ có thể dễ dàng lắp vào hầu hết các bệ mẫu AFM (Hình 1a ; thông tin chi tiết hơn được cung cấp trong Ghi chú bổ sung 2 ), tăng cường hiệu quả khả năng đo cắt tần số cao của kính hiển vi, đồng thời vẫn giữ được độ phân giải lực và không gian cao. Để tránh kích thích cộng hưởng uốn hoặc xoắn của thanh đo và giảm thiểu các hiệu ứng thủy động lực học, chúng tôi sử dụng các thanh nhỏ (USC-F1.5-k0.6, Nanoworld, Thụy Sĩ) với kích thước mặt phẳng danh nghĩa là 7 × 3 µm 2 . Tính toán hằng số độ cứng xoắn của thanh, k ϕ và độ nhạy, γ ϕ , được xác định từ phổ nhiệt xoắn trong không khí và trong dung dịch 47 (xem “Phương pháp” để biết chi tiết). Cộng hưởng xoắn cao giúp dễ dàng vận hành dưới cộng hưởng, nhưng phải trả giá bằng k ϕ cao . Độ nhạy thu được thường nằm trong phạm vi vài pN lực ngang.
Hình 1: Theo dõi độ di động của phân tử ở quy mô nano bằng công nghệ nano-rheology AFM.
Một ví dụ về phép đo nano-rheology được thể hiện trong Hình 1b đối với màng lipid được hỗ trợ bằng chất lỏng bao gồm 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (DOPC). Trong quá trình đo, đầu nhọn tiến gần đến màng từ chất lỏng và tác dụng lực pháp tuyến tăng dần, nén (điểm nổi bật màu vàng) và cuối cùng làm vỡ màng và bị ghim vào chất nền bên dưới. Ở tần số cắt 1 kHz (màu đỏ), vận tốc cắt chậm hơn nhiều so với sự khuếch tán tự nhiên của các phân tử, có thể dễ dàng sắp xếp lại xung quanh đầu nhọn để không truyền lực cắt. Ngược lại, đối với tần số cao 50 kHz (màu đen), có thể quan sát thấy lực cắt có thể đo được và độ trễ pha trên đầu nhọn. Đối với hành vi động của màng khám phá, chúng tôi đã thay đổi vận tốc cắt một cách có hệ thống bằng cách thay đổi biên độ cắt được áp dụng, A S hoặc tần số liên quan, f S. Cả hai thông số đều có thể được kiểm soát độc lập (Hình 1c ). Lực cắt có thể được hiểu một cách trực quan như là sức cản của lipid bị giữ lại dưới đầu đối với chuyển động cắt áp đặt: nếu sự khuếch tán hiệu quả của nhóm lipid chậm hơn hoặc tương đương với vận tốc cắt áp đặt, thì lực cắt ròng sẽ phát sinh. Lực cắt tăng theo A S và f S một cách nhất quán ở một tải trọng nhất định (tức là, vết lõm màng). Việc giải thích pha liên quan không đơn giản như vậy. Trong lưu biến học, pha 0° biểu thị hành vi hoàn toàn đàn hồi (giống chất rắn) trong khi 90° biểu thị hành vi hoàn toàn nhớt (chất lỏng). Pha không được xác định nếu không thể đo được lực cắt, ở đây là trước khi tiếp xúc đầu-màng. Trên vùng vết lõm, pha tăng liên tục theo hướng có hành vi nhớt hơn, nhưng nó luôn duy trì thành phần đàn hồi. Hành vi này vẫn được quan sát thấy khi thay đổi A S và f S. Khi màng (b) bị vỡ, đầu cuối cùng sẽ ghim vào chất nền, đạt đến pha bằng không ở các tải trọng cao hơn (không hiển thị). Trong khi điểm cuối cùng này xác nhận tính hợp lệ của phép đo lưu biến nano, hành vi nhớt đàn hồi rõ ràng lại trái ngược với tài liệu hiện có, trong đó cho rằng hành vi nhớt hoàn toàn đối với màng chất lỏng đơn giản 36 , 37 . Ngược lại, nước giao diện thường chậm chạp do các tương tác tương quan 48 , 49 , 50 , 51, cung cấp phản ứng nhớt đàn hồi cho đầu cắt. Ở đây, các quan sát của chúng tôi có thể được hợp lý hóa bằng đầu AFM cảm nhận động lực học kết hợp của cả lipid và nước giao diện tiếp xúc với lớp kép. Khi đầu cắt lõm vào lớp kép, nước giao diện giữa đầu cắt và màng dần dần bị đẩy ra ngoài, dẫn đến hành vi nhớt hơn, do lipid chi phối (Hình 1b, c ).
Để kiểm tra cách giải thích này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nhằm thay đổi các đặc tính của màng lipid theo cách có kiểm soát mà không ảnh hưởng đáng kể đến nước giao diện. Đầu tiên, chúng tôi thăm dò các đặc tính nano-rheological của lớp kép 1,2-dimyristoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (DMPC) ngay trên nhiệt độ chuyển tiếp của nó, tăng dần nhiệt độ theo các bước 4 °C (Hình 1d ). Xu hướng dự kiến xuất hiện 52 , với lực cắt giảm khi nhiệt độ tăng đối với một vết lõm nhất định, phản ánh tính di động của lipid được tăng cường. Sự tiến hóa pha cũng tuân theo xu hướng, mặc dù với tất cả các đường cong chồng chéo trong phạm vi lỗi. Ngoài ra, chúng tôi đã thêm một lượng cholesterol nhất định vào lớp kép DOPC, do đó làm giảm tính di động lipid trung bình của nó trong khi vẫn đảm bảo pha đồng nhất 53 . Thí nghiệm cuối cùng này khó khăn hơn, vì nó đòi hỏi phải so sánh các mẫu khác nhau, được đo trong các bộ thí nghiệm khác nhau. Kết quả (Hình 1e ) vẫn thể hiện xu hướng dự kiến với lực cắt cao hơn được đo đối với nồng độ cholesterol lớn hơn. Pha này tương tự nhau trong mọi trường hợp (trong phạm vi sai số) trên vùng lõm, về mặt định tính tuân theo hành vi quan sát được trên DOPC. Trong mọi trường hợp, có thể dễ dàng trích xuất các mô đun cắt và mất mát của mẫu, lưu ý rằng thực tế là chúng chứa thông tin về cả lớp kép lipid và lớp nước giao diện liên kết. Phù hợp với cách giải thích kết quả được đề xuất, mô đun mất mát (độ nhớt) nắm bắt tốt hơn các xu hướng lưu động màng dự kiến so với mô đun lưu trữ (đàn hồi) (xem Ghi chú bổ sung 3 để biết chi tiết).
Nhìn chung, tất cả các thí nghiệm đều hỗ trợ định tính cho cách giải thích được đề xuất về các phép đo lưu biến nano, theo đó lực cắt bị chi phối bởi hành vi của lipid ở các vết lõm cao hơn, trong khi pha mang thông tin hỗn hợp về cả nước giao diện và lipid. Để vượt ra ngoài các cân nhắc định tính, cần có hiểu biết độc lập. Do đó, chúng tôi đã tiến hành mô phỏng máy tính về quy trình đo lưu biến nano.
Một ví dụ về phép đo nano-rheology được thể hiện trong Hình 1b đối với màng lipid được hỗ trợ bằng chất lỏng bao gồm 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (DOPC). Trong quá trình đo, đầu nhọn tiến gần đến màng từ chất lỏng và tác dụng lực pháp tuyến tăng dần, nén (điểm nổi bật màu vàng) và cuối cùng làm vỡ màng và bị ghim vào chất nền bên dưới. Ở tần số cắt 1 kHz (màu đỏ), vận tốc cắt chậm hơn nhiều so với sự khuếch tán tự nhiên của các phân tử, có thể dễ dàng sắp xếp lại xung quanh đầu nhọn để không truyền lực cắt. Ngược lại, đối với tần số cao 50 kHz (màu đen), có thể quan sát thấy lực cắt có thể đo được và độ trễ pha trên đầu nhọn. Đối với hành vi động của màng khám phá, chúng tôi đã thay đổi vận tốc cắt một cách có hệ thống bằng cách thay đổi biên độ cắt được áp dụng, A S hoặc tần số liên quan, f S. Cả hai thông số đều có thể được kiểm soát độc lập (Hình 1c ). Lực cắt có thể được hiểu một cách trực quan như là sức cản của lipid bị giữ lại dưới đầu đối với chuyển động cắt áp đặt: nếu sự khuếch tán hiệu quả của nhóm lipid chậm hơn hoặc tương đương với vận tốc cắt áp đặt, thì lực cắt ròng sẽ phát sinh. Lực cắt tăng theo A S và f S một cách nhất quán ở một tải trọng nhất định (tức là, vết lõm màng). Việc giải thích pha liên quan không đơn giản như vậy. Trong lưu biến học, pha 0° biểu thị hành vi hoàn toàn đàn hồi (giống chất rắn) trong khi 90° biểu thị hành vi hoàn toàn nhớt (chất lỏng). Pha không được xác định nếu không thể đo được lực cắt, ở đây là trước khi tiếp xúc đầu-màng. Trên vùng vết lõm, pha tăng liên tục theo hướng có hành vi nhớt hơn, nhưng nó luôn duy trì thành phần đàn hồi. Hành vi này vẫn được quan sát thấy khi thay đổi A S và f S. Khi màng (b) bị vỡ, đầu cuối cùng sẽ ghim vào chất nền, đạt đến pha bằng không ở các tải trọng cao hơn (không hiển thị). Trong khi điểm cuối cùng này xác nhận tính hợp lệ của phép đo lưu biến nano, hành vi nhớt đàn hồi rõ ràng lại trái ngược với tài liệu hiện có, trong đó cho rằng hành vi nhớt hoàn toàn đối với màng chất lỏng đơn giản 36 , 37 . Ngược lại, nước giao diện thường chậm chạp do các tương tác tương quan 48 , 49 , 50 , 51, cung cấp phản ứng nhớt đàn hồi cho đầu cắt. Ở đây, các quan sát của chúng tôi có thể được hợp lý hóa bằng đầu AFM cảm nhận động lực học kết hợp của cả lipid và nước giao diện tiếp xúc với lớp kép. Khi đầu cắt lõm vào lớp kép, nước giao diện giữa đầu cắt và màng dần dần bị đẩy ra ngoài, dẫn đến hành vi nhớt hơn, do lipid chi phối (Hình 1b, c ).
Để kiểm tra cách giải thích này, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nhằm thay đổi các đặc tính của màng lipid theo cách có kiểm soát mà không ảnh hưởng đáng kể đến nước giao diện. Đầu tiên, chúng tôi thăm dò các đặc tính nano-rheological của lớp kép 1,2-dimyristoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (DMPC) ngay trên nhiệt độ chuyển tiếp của nó, tăng dần nhiệt độ theo các bước 4 °C (Hình 1d ). Xu hướng dự kiến xuất hiện 52 , với lực cắt giảm khi nhiệt độ tăng đối với một vết lõm nhất định, phản ánh tính di động của lipid được tăng cường. Sự tiến hóa pha cũng tuân theo xu hướng, mặc dù với tất cả các đường cong chồng chéo trong phạm vi lỗi. Ngoài ra, chúng tôi đã thêm một lượng cholesterol nhất định vào lớp kép DOPC, do đó làm giảm tính di động lipid trung bình của nó trong khi vẫn đảm bảo pha đồng nhất 53 . Thí nghiệm cuối cùng này khó khăn hơn, vì nó đòi hỏi phải so sánh các mẫu khác nhau, được đo trong các bộ thí nghiệm khác nhau. Kết quả (Hình 1e ) vẫn thể hiện xu hướng dự kiến với lực cắt cao hơn được đo đối với nồng độ cholesterol lớn hơn. Pha này tương tự nhau trong mọi trường hợp (trong phạm vi sai số) trên vùng lõm, về mặt định tính tuân theo hành vi quan sát được trên DOPC. Trong mọi trường hợp, có thể dễ dàng trích xuất các mô đun cắt và mất mát của mẫu, lưu ý rằng thực tế là chúng chứa thông tin về cả lớp kép lipid và lớp nước giao diện liên kết. Phù hợp với cách giải thích kết quả được đề xuất, mô đun mất mát (độ nhớt) nắm bắt tốt hơn các xu hướng lưu động màng dự kiến so với mô đun lưu trữ (đàn hồi) (xem Ghi chú bổ sung 3 để biết chi tiết).
Nhìn chung, tất cả các thí nghiệm đều hỗ trợ định tính cho cách giải thích được đề xuất về các phép đo lưu biến nano, theo đó lực cắt bị chi phối bởi hành vi của lipid ở các vết lõm cao hơn, trong khi pha mang thông tin hỗn hợp về cả nước giao diện và lipid. Để vượt ra ngoài các cân nhắc định tính, cần có hiểu biết độc lập. Do đó, chúng tôi đã tiến hành mô phỏng máy tính về quy trình đo lưu biến nano.
Mô phỏng MD
Để xác nhận tính hợp lệ của cách giải thích được đề xuất về các phép đo AFM, chúng tôi đã sao chép thí nghiệm in-silico bằng cách sử dụng mô phỏng MD hạt thô (Hình 2a , xem thêm “Phương pháp” để biết chi tiết). Với quy mô của hệ thống thử nghiệm, cần phải điều chỉnh lại một số tỷ lệ: đầu được mô hình hóa như một quả cầu silica 2 nm cắt một lớp kép DOPC trong nước, với các nhóm đầu lipid của lá dưới được cố định để mô phỏng chất nền hỗ trợ. Các mô phỏng làm nổi bật vai trò quan trọng của nước giao diện, đặc biệt là các phân tử nước hydrat hóa được hấp phụ mạnh vào các nhóm đầu lipid. Các phân tử nước này vẫn nằm giữa đầu ảo và bề mặt màng ở các lực pháp tuyến được áp dụng thấp hơn (được tô màu xanh lam trong Hình 2a , phần chèn bên trái), nhưng bị loại bỏ dần ở các tải cao hơn (Hình 2a , phần chèn bên phải), xác nhận cách giải thích thử nghiệm được đề xuất. Sự chuyển đổi từ cắt hydrat hóa sang không hydrat hóa trùng với sự xuất hiện của một trạng thái ổn định trong sự tách biệt đầu-màng trung bình và sự gia tăng lực cắt được đo. Ở tải trọng áp dụng thấp (độ lõm thấp), lực cắt bị chi phối bởi động lực của nước giao diện được hấp thụ vào màng, trong khi cao nguyên trùng với lực cắt ‘trực tiếp’ của lipid dưới đầu AFM. Trong chế độ thứ hai này, phép đo bị chi phối bởi hành vi của lipid, phù hợp với các quan sát về lưu biến nano.
Hình 2: Mô phỏng động lực học phân tử của phép đo lưu biến nano.
Các mô phỏng hiện tại cũng làm nổi bật thực tế rằng nước đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát động lực học và trao đổi tại các giao diện sinh học: các vật thể và phân tử ở quy mô nano di chuyển gần màng sinh học gặp phải một lớp nước bảo vệ hoạt động hiệu quả như một chất bôi trơn 54 . Cần có lực pháp tuyến tương đối cao hơn để loại bỏ lớp bôi trơn này ở vận tốc cao hơn, ở đây là 150 pN đối với vật thể 2 nm di chuyển với tốc độ 200 mm s -1 (Hình 2a ).
Hướng tới một mô hình định lượng
Theo thực nghiệm và đối với một tải trọng được áp dụng nhất định (tức là vết lõm màng), việc vẽ đồ thị lực cắt được đo theo vận tốc cắt trung bình bình phương căn bậc hai ( v S ) cho thấy sự gia tăng tuyến tính của F S theo v S (Hình 2b ). Điều này vẫn đúng bất kể A S và f S có được sử dụng để thay đổi v S hay không (Hình 1c ). Các mô phỏng MD xác nhận rằng AFM có thể thăm dò trực tiếp động lực học của lipid ở các tải trọng cao hơn, nhưng việc so sánh trực tiếp với dữ liệu thực nghiệm đòi hỏi một số chuẩn hóa của lực cắt được đo bằng diện tích tiếp xúc đầu-lipid – tương đương với ứng suất cắt trên màng. Chiến lược này bù đắp ngầm cho sự khác biệt về tải trọng được áp dụng hoặc kích thước đầu vì cả hai đều ảnh hưởng đến lực cắt thông qua diện tích tiếp xúc. Hình 2b cho thấy ứng suất, , đối với các phép đo AFM và các mô phỏng MD thu được trên sáu cấp độ lớn của vận tốc cắt, cho thấy sự phù hợp tốt. Nguồn lỗi chính xuất phát từ ước tính , một thách thức đối với các mô phỏng MD do hệ thống có hạt thô và kích thước tương đối nhỏ của đầu. Ước tính không chính xác của có thể dịch chuyển các điểm dữ liệu trong Hình 2b theo chiều dọc, nhưng sự phụ thuộc tuyến tính vào vận tốc đối với cả hai kỹ thuật xác nhận cách giải thích dữ liệu AFM thông qua Phương trình ( 1 ) (trình bày sau đây). Thực tế là tính tuyến tính được bảo toàn trên sáu cấp độ lớn là điều đáng chú ý nhưng phù hợp với hệ thống luôn duy trì ở chế độ số Reynolds thấp. Các mô phỏng cũng làm nổi bật thêm tầm quan trọng của nước hydrat hóa đối với hành vi cắt giao diện.A{F}_{{{\rm{S}}}}/A A AFS/AAA
Nhìn chung, tính tuyến tính của lực cắt với vận tốc cắt cho thấy sự tồn tại của một mối quan hệ đơn giản giữa các thông số có thể đo được và khả năng khuếch tán của các phân tử dưới đầu nhọn. Giả sử rằng lực cắt có liên hệ trực tiếp với tính di động hữu hạn của lipid dưới đỉnh đầu nhọn, thì cái gọi là mối quan hệ Einstein 29 đối với sự khuếch tán có thể được sử dụng để trích xuất cả tính di động phân tử và hệ số khuếch tán, trong đó vận tốc cắt tương tự như vận tốc trôi dạt cuối cùng dưới lực cắt được áp dụng. Hệ số khuếch tán hiệu dụng này phải được chia tỷ lệ để phản ánh thực tế là đầu nhọn, mặc dù sắc nét nanomet, vẫn thẩm vấn nhiều phân tử khi nó ép vào màng. Đối với các màng được hỗ trợ trong dung dịch, điều này được mô hình Evans-Sackmann 55 , 56 nắm bắt được trong đó hệ số khuếch tán hiệu dụng của một tạp chất giống như đĩa trong màng có diện tích (ở đây, lipid bị giữ lại bên dưới đầu nhọn cắt) tỷ lệ với nghịch đảo của diện tích của nó. Ở đây, với là bán kính đầu và là độ sâu lõm của nó vào màng. Cả hai đại lượng đều có thể truy cập trực tiếp thông qua phép đo và có thể thu được riêng biệt. Kết hợp các mô hình Einstein và Evans-Sackmann dẫn đến phương trình sau liên kết trực tiếp hệ số khuếch tán cục bộ của lipid với các quan sát thực nghiệm (xem Ghi chú bổ sung 1.2 để biết chi tiết):
DAA=2πRtipΔhRtipΔhRtip
Với TALipidALipidDDD = 5,8 ± 0,6 µm 2 s -1
Ứng dụng cho mô hình màng ba thành phần
Sau khi thiết lập được tính mạnh mẽ của phương pháp, chúng tôi minh họa khả năng của nó trên các màng mô hình phức tạp bao gồm hỗn hợp lipid ba thành phần của sphingomyelin (SM), DOPC và cholesterol, theo tỷ lệ mol tương ứng là 4:4:2. Màng này thể hiện các miền trật tự theo chất lỏng ( L O ) và hỗn loạn theo chất lỏng ( L D ) riêng biệt dễ dàng nhận dạng được từ chênh lệch chiều cao của chúng (Hình 3a ), như mong đợi từ nhiệt độ tới hạn cao của hỗn hợp 58. Bản đồ khuếch tán cục bộ liên quan cho thấy hệ số khuếch tán thấp hơn dự kiến trong các vùng L O (Hình 3b ). Các đường cong quang phổ liên quan thu được trên các vùng L O và L D (Hình 3c ) chồng lên nhau trên ≈1,5 nm đầu tiên khi D tính toán
tăng theo vết lõm, tiếp theo là cao nguyên cụ thể của miền được sử dụng để suy ra hệ số khuếch tán tại mỗi vị trí. Vùng chồng lấn của các đường cong quang phổ phù hợp với nước hydrat hóa của lipid đóng vai trò là lớp bôi trơn 59 , 60 , như đã quan sát thấy trong các mô phỏng của chúng tôi (Hình 2a ). Ở đây, các nhóm đầu lipid tiếp xúc giống hệt nhau trên tất cả các vùng, giải thích cho sự tương đồng rõ ràng của các đường cong. Phân tích thống kê của D trên các cao nguyên tạo ra biểu đồ tần suất với độ lan truyền ≈20% xung quanh giá trị trung bình, đặc biệt là đối với các vùng L O (Hình 3d ). Độ lan truyền này thể hiện các biến thể nano thực sự của quá trình khuếch tán trên một miền nhất định chứ không phải là lỗi thựcnghiệm. Độ lan truyền này trầm trọng hơn trên các miền L O do tính di động phân tử thấp hơn khiến phép đo nhạy cảm hơn với các biến thể phân tử cục bộ. Sự phụ thuộc vào các biến thể cục bộ này gợi ý một số tương quan không gian có thể có trong khả năng khuếch tán qua màng. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi tính toán cái gọi là độ trễ không gian 61 , Y SL , trên toàn bộ bản đồ khuếch tán. Y SL mô tả mối tương quan thống kê giữa hệ số khuếch tán chuẩn hóa của các vị trí đo liền kề trong mỗi pha lipid (Hình 2e , xem thêm Ghi chú bổ sung 1.3 để biết thêm chi tiết). Kiểm tra thống kê tính toán giá trị tương quan (giá trị Moran 61 , I ) từ Y SL khác nhau ; I > 0 biểu thị mối tương quan không gian. Ở đây chúng ta tìm thấy mối tương quan dương, với I = 0,158 ± 0,042 (n = 816), như minh họa bằng đồ họa trong Hình 2f và có ý nghĩa thống kê mạnh ( p < 0,0025). Điều này xác nhận rằng sự khuếch tán cục bộ phụ thuộc toàn cầu vào môi trường nano ngay lập tức (xem Ghi chú bổ sung 1.3 để biết thêm chi tiết về thử nghiệm). Tiến hành cùng một phân tích riêng biệt trên các miền L O và L D xác nhận rằng có các tương quan không gian trong sự khuếch tán trên cả hai miền, nhưng với mức độ tương quan cao hơn ba lần đối với các vùng L O ( I LO = 0,146 ± 0,007, n LO = 291; I LD = 0,051 ± 0,049, n LO = 461). Các kết quả đều có ý nghĩa thống kê trong cả hai trường hợp, nhưng hình học phân mảnh của các miền và tập hợp dữ liệu giảm có sẵn cho mỗi vùng khiến cho phép phân tích kém mạnh mẽ hơn so với trên toàn bộ hình ảnh. Các vùng ranh giới cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập các tương quan bên, mặc dù không dễ giải quyết ở đây do kích thước nhỏ của vùng có liên quan. Nhìn chung, các kết quả xác nhận rằng sự lan truyền trong các giá trị khuếch tán trên các miền khác nhau (Hình 3d ) phản ánh một số tương quan không gian bên trong màng. Chúng cũng thiết lập nhu cầu về các phép đo cục bộ, ở quy mô nano về độ di động của phân tử để có được dữ liệu có ý nghĩa: nếu các tương quan không gian rõ ràng trong các lớp kép ba lớp lý tưởng trên một chất nền phẳng nguyên tử, thì chúng chắc chắn sẽ có ý nghĩa hơn trong các màng tự nhiên phức tạp.
Đo lường trên màng thủy tinh thể của một giống bò bản địa
Dựa trên kết quả tính toán và thử nghiệm thu được trên màng mô hình, chúng tôi đã thực hiện các phép đo lưu biến nano trên các mảnh màng thủy tinh thể mắt bò bản địa 62 , 63 (Hình 4 ). Màng thủy tinh thể là một hệ thống thú vị để thẩm vấn bằng kỹ thuật của chúng tôi do hàm lượng cholesterol cao và sự tồn tại của các vùng có hành vi động không đồng nhất trên khoảng cách hàng chục nanomet. Điều này bao gồm các miền giàu lipid, lưu động hơn (Hình 4a , mũi tên làm nổi bật), các miền giàu protein – được đánh dấu bằng dấu gạch ngang màu trắng – với các tinh thể aquaporin tứ phân tử tự nhiên (mũi tên làm nổi bật) và các vùng trung gian nơi các tinh thể protein đang lắp ráp/tháo rời (mũi tên làm nổi bật). Các vùng trung gian này có liên quan chức năng đáng kể trong quá trình phát triển của các tế bào thủy tinh thể, cho phép hình thành sự sắp xếp kênh protein phù hợp để kết nối với các tế bào lân cận và đảm bảo vi tuần hoàn quan trọng của các chất chuyển hóa. Các phép đo cắt được thực hiện trên các vùng khác nhau này của cùng một mảnh màng chứng minh những biến thể quan trọng trong khả năng khuếch tán cục bộ. Trên 150 nm, \(D\) thay đổi hơn một cấp độ, với sự thay đổi rõ rệt trên các khoảng cách nhỏ tới 20 nm. Điều quan trọng cần lưu ý là các hệ số khuếch tán trong Hình 4d được suy ra bằng Công thức ( 1 ), ngầm định giả định một màng chất lỏng và lipid là loài khuếch tán chính được thăm dò. Điều này không nhất thiết đúng đối với các vùng giàu protein (vị trí 6, 7), trong đó diện tích của một protein nên được sử dụng thay vì diện tích của một phân tử lipid trong Công thức ( 1 ). Sự thay thế này sẽ làm giảm thêm hệ số khuếch tán được đo theo cấp độ, phù hợp với các cụm protein bất động được quan sát thấy. Đối với các tinh thể protein, giả định về màng chất lỏng không còn áp dụng nữa và Công thức ( 1 ) không còn hợp lệ. Đầu dò vẫn có thể được sử dụng để phá vỡ các cụm protein, đảo ngược các miền có trật tự trong các vùng có tính di động phân tử cao hơn, dẫn đến việc phục hồi hệ số khuếch tán hữu hạn (Ghi chú bổ sung 5 ). Tuy nhiên, sau đó không còn rõ ràng về sự khuếch tán phân tử nào (protein hay lipid) đang được thăm dò. Tổng hợp lại, những kết quả này ủng hộ ý tưởng về các gradient phân tử tầm ngắn trong màng điều chỉnh các đặc tính sinh lý học của màng cục bộ và kiểm soát quá trình tự lắp ráp protein, phù hợp với khái niệm bè 19 cục bộ và tạm thời điều chỉnh các đặc tính của màng. Điều này minh họa cho cả tính linh hoạt và độ chính xác của phương pháp, cũng như nhu cầu áp dụng các phép đo như vậy thường xuyên cho màng sinh học nếu muốn có được bức tranh chức năng.
Hình 4: Bản đồ khuếch tán ở quy mô nano của màng thủy tinh thể mắt bò bản địa.
Chúng tôi đã phát triển một phương pháp mới để định lượng độ di động phân tử trong mặt phẳng của màng được hỗ trợ với độ phân giải không gian nanomet. Kỹ thuật của chúng tôi sử dụng nano-rheology để vượt qua các giới hạn thời gian thông thường của AFM để giải quyết động lực học trong mặt phẳng và nắm bắt động lực học màng cục bộ. Phương pháp này cung cấp một số lợi thế so với các kỹ thuật hiện có, nhưng nó cũng có những hạn chế. Những lợi thế chính bắt nguồn từ bản chất ‘cơ học’ của phép đo cung cấp hình ảnh độ nhớt đàn hồi đầy đủ của các giao diện, thăm dò cả lipid và nước giao diện. Phép đo này mô phỏng hiệu quả những gì một vật thể hoặc phân tử ở quy mô nano khuếch tán trong vùng lân cận của màng trải qua, thăm dò các lực đang tác động. Nó hoạt động tại chỗ, cục bộ, ở quy mô nano và không yêu cầu bất kỳ nhãn hóa học hoặc vật lý nào đối với mẫu. Khả năng định lượng phản ứng độ nhớt đàn hồi của màng có thể đặc biệt hữu ích đối với các hệ thống phức tạp có sự thay đổi cục bộ đáng kể về tính chất cơ học và động lực học, một điều khó khăn đối với các phương pháp hiện có. Những hạn chế của kỹ thuật chủ yếu xuất phát từ nhu cầu tiếp cận vật lý với mẫu phải được cố định. Trong các hệ thống sinh học, điều này giới hạn phép đo đối với các phức hợp màng ngoài nếu được thực hiện trên các tế bào sống hoặc đối với các mảnh tế bào và bào quan được hỗ trợ, như trong bài báo này. Ngoài bản thân phép đo, việc giải thích kết quả theo tính di động của màng cục bộ phụ thuộc vào các giả định phải được xác minh để có giá trị. Đầu tiên, mẫu cần phải ở dạng lỏng. Thứ hai, mô hình Evans-Sackman 55 , 56 được sử dụng trong mô hình được phát triển ở đây chỉ có giá trị đối với các màng lipid được hỗ trợ. Một mối quan hệ Saffman-Delbrück tổng quát hơn tồn tại đối với các màng lơ lửng 64 , nhưng nó ít thuận lợi hơn để đạt được các phép đo cục bộ cao do phụ thuộc logarit vào diện tích được thăm dò. Thứ ba, mô hình của chúng tôi giả định kiến thức về các loài phân tử khuếch tán đang được thăm dò và kích thước tương ứng của chúng, như được mô tả trong Phương trình ( 1 ). Mặc dù đơn giản đối với màng lipid, nhưng điều này trở nên khó khăn hơn đối với màng huyết tương chứa một lượng lớn protein và đường. Cuối cùng, các giá trị hệ số khuếch tán thu được mang theo một lỗi liên quan đến hình học không hoàn hảo của hệ thống, so với mô hình lý tưởng: đỉnh đầu không bao giờ hoàn toàn hình cầu và kích thước đo được của nó được coi là hiệu quả. Tuy nhiên, lỗi kết quả là có hệ thống và ảnh hưởng đến từng phép đo với một đầu nhất định theo cùng một cách. Do đó, sức mạnh của kỹ thuật nằm ở việc lập bản đồ các biến thể tương đối trên một mẫu, như minh họa trong Hình 3 , 4. Trên các màng sinh học mô hình, kết quả định lượng các biến thể cục bộ trong khả năng khuếch tán lipid ngay cả trong các pha đồng nhất rõ ràng, cho thấy các hiệu ứng tương quan ở quy mô nanomet. Các phép đo trên màng thấu kính tự nhiên cũng minh họa tiềm năng của kỹ thuật này trong việc lập bản đồ các thay đổi ở quy mô nano có liên quan về mặt chức năng trong khả năng khuếch tán phân tử trên các màng phức tạp. Khả năng của kỹ thuật trong việc đo phản ứng nhớt đàn hồi của toàn bộ hệ thống (màng và nước giao diện) cho thấy rằng trong khi hệ thống là nhớt đàn hồi, điều này chủ yếu được thúc đẩy bởi nước giao diện với màng lipid đơn giản hoạt động chủ yếu như nhớt, do đó cho phép áp dụng Phương trình ( 1 ). Điều này nhấn mạnh sự tương tác giữa động lực học của lipid và động lực học của nước, cũng như rõ ràng từ các mô đun lưu trữ (đàn hồi) và mất mát (nhớt) giao diện (Ghi chú bổ sung 3 ) và được xác nhận bởi các mô phỏng máy tính.
Về độ phân giải không gian-thời gian, kỹ thuật này được định vị lý tưởng để bổ sung cho các phương pháp quang học hiện có 32 , 33 , 34 dựa trên siêu phân giải và có thể định lượng sự khuếch tán của các loài được gắn nhãn trong cơ thể sống với độ phân giải thường là ≈1 ms và 50-100 nm. Đối với các phương pháp dựa trên đầu dò quét, chúng tôi dự đoán kỹ thuật này sẽ đặc biệt hữu ích để định lượng sự khuếch tán của lipid trong màng chất lỏng, bổ sung cho các phương pháp hiện có 41 được phát triển để theo dõi các thay đổi về cấu hình của protein trên thang thời gian tương tự.
Phương pháp
Lắp ráp thiết bị nano-rheological
Thiết bị (xem Hình bổ sung 2 ) bao gồm bộ truyền động áp điện cắt điện áp thấp với các tiếp điểm bằng đồng và tấm cuối gốc alumina (PL5FBP3, Thorlabs, NJ, Hoa Kỳ), có tần số cộng hưởng danh nghĩa là 1,9 MHz. Thiết bị này được gắn bằng epoxy hai thành phần (Araldite Ultra-Strong, Basel, Thụy Sĩ) vào một đĩa AFM bằng thép tiêu chuẩn (đường kính 15 mm, Agar Scientific, Vương quốc Anh) ở một mặt để ghép nối nhiệt cơ với bệ AFM. Sau đó, đĩa piezo, đĩa và dây được phủ băng dính polyimide (Kapton, DuPont) để bảo vệ các thành phần khỏi dung dịch đệm điện phân. Đĩa mica được sử dụng làm chất nền (đường kính 3 mm, chất lượng V-1, SPI supplies, PA, Hoa Kỳ) sau đó được gắn vào đĩa này bằng epoxy. Cuối cùng, để đảm bảo độ dẫn nhiệt thích hợp giữa bệ Peltier của AFM và giọt chất lỏng mẫu, sơn bạc dẫn điện (Leitsilber, Ted Pella Inc., CA, Hoa Kỳ) đã được phủ từ đĩa thép đến vùng lân cận của mica (cách ≈ 2 mm). Chi tiết về hiệu chuẩn, thử nghiệm và tối ưu hóa thiết bị được trình bày trong Ghi chú bổ sung 2. Toàn bộ thiết bị được lắp đặt trong AFM thương mại (Asylum Research Cypher-ES, Oxford Instruments, Oxford, Vương quốc Anh) và được kết nối với bộ khuếch đại khóa ngoài (MFLI, Zurich Instruments, Zurich, Thụy Sĩ).
Chuẩn bị mẫu
Tất cả các dụng cụ thủy tinh, bao gồm cả các thành phần của máy đùn lipid mini (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL, Hoa Kỳ), đều được làm sạch bằng phương pháp siêu âm và rửa sạch dần trong 5 vol.% Decon-90 (Fisher Scientific, Loughborough, Vương quốc Anh); nước siêu tinh khiết (18,2 MΩ cm, Milli-Q, Merck-Millipore, Watford, Vương quốc Anh); IPA (2-propanol, > 99,5%, Fisher Scientific, Loughborough, Vương quốc Anh), sau đó rửa sạch lần cuối bằng nước siêu tinh khiết, trước khi sấy khô dưới luồng khí nitơ hoặc ở 60 °C. Trong mọi trường hợp, dung dịch tạo ảnh và lắng đọng (sau đây gọi là “dung dịch đệm”) bao gồm 150 mM NaCl và 2 mM CaCl2 (cả hai đều là thuốc thử Sigma Aldrich, ACS, độ tinh khiết > 99% (NaCl) và độ tinh khiết > 96% (CaCl2 )) trong nước siêu tinh khiết. Sản phẩm được pha ở nồng độ 10 lần, lọc bằng ống tiêm và pha loãng thành 1 lần bằng nước siêu tinh khiết nếu cần.
Các lớp kép lipid được hỗ trợ tinh khiết được sản xuất từ các túi nhỏ, đơn lớp (SUV) theo sau là phương pháp hợp nhất túi 65 . 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (DOPC), sphingomyelin (SM, não lợn) và cholesterol được mua từ Merck/Sigma-Aldrich (Gillingham, Vương quốc Anh) và sử dụng mà không cần tinh chế thêm. Các tỷ lệ mol lipid thích hợp (DOPC 100%, DMPC 100%, DOPC 9:1:cholesterol, DOPC 8:2:cholesterol, DOPC 6:4:cholesterol hoặc DOPC 4:4:2:SM:cholesterol) được kết hợp trong cloroform và sau đó dung môi được bốc hơi nhẹ dưới luồng khí nitơ theo sau là > 2 giờ trong bình hút ẩm chân không để đảm bảo dung môi bay hơi hoàn toàn. Sau đó, lipid được ngậm nước trở lại trong dung dịch đệm hình ảnh (150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 ) đến nồng độ 1,0 mg mL -1 . Đầu tiên, các mẫu được đồng nhất hóa bằng cách xoáy trong 10 giây, sau đó siêu âm trong bồn ở 40 °C trong 30 phút để tạo thành các túi nhiều lớp. 1,2 mg dung dịch này được cân bằng trong máy đùn lipid mini (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL, Hoa Kỳ) ở 50 °C trong 20 phút, trước khi đùn 27 lần qua bộ lọc 100 nm (Whatman, Sigma Aldrich) để tạo ra hỗn dịch SUV trong suốt được giữ ở 5 °C trong không quá 5 ngày. Vào ngày thử nghiệm, thiết bị cắt được lắp vào AFM và bệ mẫu được làm nóng đến 45 °C. Sau đó, mica được cắt và rửa sạch bằng 3 × 5 μL dung dịch đệm hình ảnh. 5 µL dung dịch huyền phù SUV được nhỏ vào mica, ủ ở 45 °C trong 10 phút, trước khi giảm xuống 20 °C trong 15 phút. Để loại bỏ bất kỳ túi nào còn lại, đã hấp phụ hoặc trong dung dịch, sau đó rửa sạch giọt bằng 15 × 5 µL dung dịch đệm hình ảnh. Luôn cẩn thận không để giọt bay hơi hoặc để bề mặt mica tiếp xúc với không khí.
Đối với phép đo trên DMPC, mẫu được đưa đến nhiệt độ mong muốn bằng cách sử dụng bộ điều khiển nhiệt độ AFM (1 °C phút -1 ) và các thí nghiệm được tiến hành tuần tự ở 26, 30, 34 và 38 °C. Trong mỗi trường hợp, mẫu được để trong 5 phút để cân bằng sau khi đạt đến nhiệt độ mong muốn và các tiếp xúc bạc với chất nền đảm bảo dẫn nhiệt tối ưu.
Đối với DOPC với các thí nghiệm cholesterol, các phép đo được tiến hành có chủ đích theo thứ tự ngẫu nhiên (10% cholesterol, 40% cholesterol, 20% cholesterol) để tránh bất kỳ sai lệch thử nghiệm nào có thể xảy ra. Một (mẹo mới) tương tự đã được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm.
Các mảnh màng thấu kính mắt bò được chuẩn bị bằng phương pháp chiết xuất tuần tự tiêu chuẩn 66 , 67 . Tóm lại, thấu kính bò tươi được tách vỏ và sau đó khuấy trên đá trong 20–30 phút theo tỷ lệ trọng lượng trên thể tích là 1:2 của dung dịch đệm chiết xuất (natri phosphat 10 mM pH 7,4; NaCl 150 mM, EDTA 5 mM). Vật liệu thấu kính được đổ ra để lại thấu kính còn lại. Sau thời gian khuấy lâu hơn, thấu kính bị phân tách hoàn toàn và vật liệu thấu kính tách ra được Dounce đồng nhất hóa. Sau đó, phần làm giàu màng được tách ra khỏi phần protein hòa tan bằng cách ly tâm (rôto Beckman JA20; 48400 × g ở 41 °C trong 20 phút). Viên chứa màng thấu kính một lần nữa được Dounce đồng nhất hóa để tái huyền phù màng và chiết xuất lại bằng cùng một dung dịch đệm. Quá trình tái huyền phù, khuấy trên đá và ly tâm được lặp lại liên tiếp trong các dung dịch đệm sau: Natri phosphat 10 mM pH 7,4, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM; amoni bicarbonate 10 mM, EDTA 1 mM; natri phosphat 10 mM pH 7,4, urê 8 M và EDTA 5 mM; natri hydroxit 0,1 M. Sau đó, màng thấu kính được rửa một lần nữa trong dung dịch đệm chiết xuất và sau đó được tái huyền phù trong dung dịch đệm này có chứa 0,01% (w/v) natri azide, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C hoặc đông lạnh ở -20 °C để sử dụng sau. Để chuẩn bị các mẫu AFM, một phần nhỏ được để rã đông ở nhiệt độ phòng rồi trộn nhẹ bằng pipet. 20 μL được rút ra và trộn với 60 μL CaCl2 40 mM . Sau đó, bề mặt mica được cắt ra và rửa sạch bằng 3 × 5 μL CaCl2 40 mM trước khi nhỏ 5 μL dung dịch mảnh thấu kính vào đó và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Đo lường AFM
Trong mọi trường hợp, Cypher-ES AFM (Asylum Research, Oxford Instruments, CA, Hoa Kỳ) được trang bị bệ Peltier để kiểm soát nhiệt độ (Δ T = ± 0,1 °C), kích thích quang nhiệt và một điểm phát hiện laser nhỏ đã được sử dụng. Các thanh đỡ nhỏ đã được sử dụng (USC-F1.5-k0.6, Nanoworld, Thụy Sĩ) với một đòn bẩy mới được sử dụng cho mỗi bộ thí nghiệm. Trước khi thí nghiệm, các thanh đỡ được rửa liên tiếp bằng acetone, IPA và nước siêu tinh khiết. Độ cứng uốn của chúng được tính toán từ phổ nhiệt của chúng được ghi lại trong dung dịch hình ảnh 68 và không lệch đáng kể so với giá trị danh nghĩa của chúng (phạm vi điển hình là 0,45-0,8 nN nm -1 ). Độ cứng ngang và độ nhạy quang học của đòn bẩy được hiệu chuẩn tại chỗ bằng các phương pháp không phá hủy dựa trên phổ nhiệt xoắn 47 , 69 invOLS được lấy từ phép khớp tuyến tính của độ lệch đòn bẩy so với phần mở rộng z -piezo khi tiếp xúc chặt với chất nền mica, sử dụng phần mềm điều khiển AFM của Asylum Research dành cho Igor Pro (Wavemetrics, OR, Hoa Kỳ).
Chụp ảnh được thực hiện ở chế độ điều chế biên độ, với đòn bẩy được kích thích quang nhiệt gần tần số cộng hưởng của nó (≈ 900 kHz) sao cho nó có biên độ tự do (uốn cong) trong bộ đệm chụp ảnh khối lượng lớn của A 0 ≈ 1-2 nm. Biên độ điểm đặt được sử dụng để phản hồi chụp ảnh được giữ > 0,7 A 0 để đảm bảo chụp ảnh nhẹ nhàng trong khi vẫn theo dõi chính xác địa hình 70 , 71 .
Dữ liệu quang phổ được trình bày trong Hình 1 , 2 , 4 được thu thập ở chế độ lực tĩnh, với vận tốc tiếp cận là 30 nm s −1 . Lực pháp tuyến được áp dụng được lấy trực tiếp từ độ lệch uốn của thanh nhô. Đồng thời, bộ khuếch đại khóa-in đã áp dụng điện thế sin cho áp điện cắt, kích hoạt nó với tần số < 50 kHz và với độ dịch chuyển 1-7 nm (chi tiết về hiệu chuẩn áp điện vòng hở trong Ghi chú bổ sung 2 ). Chuyển động ngang của tia laser AFM trên điốt quang (Hình 1a ) được gửi vào khóa-in và được sử dụng để định lượng biên độ và độ lệch pha, so với chuyển động áp điện. Biên độ đo được đã được sử dụng để tính toán lực ngang trên đầu, FL như sau 69 :
trong đó γ tors là độ nhạy quang xoắn (theo rad V ˗1 ), k ϕ là độ cứng xoắn của đòn bẩy (theo N rad −1 ), sau đó được chuyển đổi thành độ cứng ngang của cần đòn bẩy, k L (theo N m ˗1 ), bằng cách xem xét chiều dài cần đòn bẩy L , và chiều cao, h tip , và độ lùi của tip , Δ L . Độ nhạy quang xoắn không phải là nội tại của cần đòn bẩy và phụ thuộc vào đường dẫn quang học cụ thể của tia laser phát hiện, cũng như hình học AFM và do đó phải được tính toán cho mỗi đòn bẩy tại chỗ từ phổ nhiệt xoắn 47 , 69
Ở đây kB là hằng số Boltzmann và T là nhiệt độ tuyệt đối. Các biến f 0 , P DC và Q được lấy từ phép khớp Lorentzian được thực hiện trên mật độ phổ công suất xoắn. Đối với k ϕ , chúng tôi sử dụng phương pháp dựa trên phổ nhiệt xoắn của đòn bẩy được đo trong cả không khí và đệm 47 .
Đối với phép đo quang phổ ở tần số cao hơn (≥ 25 kHz), hằng số thời gian khóa τ = 199,8 µs đã được sử dụng, nhưng đối với tần số thấp hơn, hằng số này được tăng dần để tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, kết thúc bằng τ = 1,973 ms ở tần số cắt 1 kHz. Tất cả các điểm dữ liệu trong Hình 1 c–e, 2 c và 4c biểu thị giá trị trung bình, với các thanh lỗi trải dài trên một độ lệch chuẩn của > 15 đường cong lực cho mỗi bộ tham số.
Đối với bản đồ khuếch tán trong Hình 3b , chế độ ‘bản đồ lực’ của phần mềm Asylum Research đã được sử dụng, với vận tốc đầu thẳng đứng là 120 nm s -1 và tốc độ lấy mẫu dữ liệu là 6,25 kHz. Áp điện cắt được điều khiển bằng tín hiệu 25 kHz và độ dịch chuyển tối đa là 5 nm. Bản đồ biểu diễn hệ số khuếch tán trung bình của các giá trị tại độ lõm δ = 2,0 ± 0,5 nm. Tất cả các phân tích đều được thực hiện trong Igor Pro (Wavemetrics, OR, Hoa Kỳ) bằng các tập lệnh tùy chỉnh. Hình ảnh AFM chuẩn được chụp ngay trước và sau khi chụp bản đồ để đánh giá khả năng trôi dạt và đảm bảo diễn giải chính xác dữ liệu (chi tiết hơn trong Hình bổ sung 11 ).
Mô phỏng MD
Mô phỏng động lực học phân tử hạt thô (CGMD) của các phép đo lưu biến nano đã được thực hiện bằng cách sử dụng trường lực MARTINI 72 với các bước thời gian là 40 fs. Trước khi mô phỏng chính, năng lượng được giảm thiểu, với mô phỏng cân bằng là 80 ns. Nước và các ion cùng phần còn lại của hệ thống được điều chỉnh nhiệt độ độc lập ở nhiệt độ 300 K, triển khai hai bộ điều chỉnh nhiệt Bussi để tránh tạo ra các điểm nóng và lạnh trong hộp mô phỏng 73. Ghép nối áp suất tổng thể mở rộng của Parrinello-Rahman đã được điều chỉnh để kiểm soát áp suất ở mức 1 bar với kích thước x và y của hộp mô phỏng vẫn giữ nguyên, trong khi kích thước z thích ứng với các thay đổi áp suất một cách độc lập 74. Mô phỏng MD được điều khiển 75 (SMD) đã được triển khai để mô phỏng các thí nghiệm cắt AFM một cách trung thực nhất có thể. Để đạt được mục đích này, một lớp kép lipid được tạo thành từ 722 lipid DOPC đã được chế tạo và hòa tan trong 16000 hạt nước martini (hạt chống đông 10%), với nồng độ NaCl là 150 mM (Hình bổ sung 12 ). Một đầu hình cầu được tạo thành từ các hạt silica MARTINI đã được chế tạo với bán kính 2 nm. Tổng kích thước của hộp mô phỏng là 15,51 × 15,51 × 12,80 nm 3 (xem Bảng bổ sung 2 để biết chi tiết về các tham số mô phỏng). Các lực vuông góc với mặt phẳng màng (tương đương với tải trọng pháp tuyến, F N , được áp dụng theo thực nghiệm) đã được tác dụng vào đầu trong khi theo hướng song song, đầu được kéo với vận tốc xác định trong phạm vi 5 × 10 3 − 1,5 × 10 6 µm s −1 .
Để mô phỏng hiệu ứng của lớp hỗ trợ mica ưa nước trên lipid, các nhóm đầu lipid của lá dưới đã được cố định. Điều này đã được so sánh với các mô phỏng không có bất kỳ ràng buộc nào (đứng tự do). Ở F N thấp, nước giao diện hiện diện giữa đầu và lipid trong cả hai trường hợp và lực cắt được đo là tương đương nhau. Ở tải trọng cao hơn, nước giao diện này chỉ bị ép ra đối với màng bị ràng buộc, dẫn đến lực cắt tăng mạnh (Hình bổ sung 13 ). Phân tích lỗi cho thấy cần ít nhất 30 lần lặp lại của bất kỳ mô phỏng nào để đạt được độ chính xác 20% về giá trị trung bình. Theo đó, mỗi mô phỏng kéo được lặp lại ít nhất 50 lần. Mã Python và bash đã được viết để phân tích kết quả mô phỏng kéo. Trong tất cả các mô phỏng, bước thời gian 40 fs đã được áp dụng. Khi động lực học của hệ thống với hạt thô martini tăng lên gấp bốn lần 76 , thời gian mô phỏng và tốc độ kéo được báo cáo trong nghiên cứu hiện tại dựa trên thời gian thực ước tính, gấp bốn lần thời gian mô phỏng. Các thông số cụ thể cho mô phỏng được trình bày chi tiết trong Bảng bổ sung 2 .
